Biologische Rezeptoren für Licht bzw. licht-getriebene Katalyse 

Blaulichtrezeptoren und licht-getriebene DNA-Reparatur

 

Unter dem Einfluss energiereicher UV-Strahlung können sich aus zwei auf einem DNA-Strang benachbarten Pyrimidinen ein Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer oder (6-4)-Photoprodukte bilden. Da hierbei die Struktur der DNA verändert wird und eine Replikation durch die DNA-Polymerase nicht mehr stattfinden kann, führt dies zu Mutationen in der Zelle. Photolyasen können diese DNA-Schäden mit Hilfe von Licht wieder reparieren und somit das Genom stabilisieren. Dies ist ein möglicher Ansatz für eine effektive Therapie z. B. gegen Hautkrebs.

 

Um mehr über den zugrunde liegenden Reparatur-mechanismus zu lernen, beschäftigen wir uns mit mehreren Vertretern dieser überaus interessanten Enzymklasse, die in den unterschiedlichsten Organismen vorkommt.

Vor kurzem gelang es uns, einen Komplex des Enzyms mit einem gebundenen DNA-Schaden herzustellen und röntgen-kristallographisch zu charakterisieren (siehe links, Mees et al., 2004). Dadurch konnten detaillierte Informationen über die genaue Wirkungsweise des Enzyms mit geschädigter DNA gewonnen werden. Durch den Einbau synthetischer Antennenpigmente in Photolyasen erhoffen wir zudem, Biohybride dieser Photolyasen herzustellen, die andere Wirkspektren als die natürlichen Enzyme aufweisen (Klar et al., 2006). Weitere Arbeiten unserer Gruppe beschäftigen sich mit Klasse II Photolyasen, die in Pflanzen und tierischen Organismen vorkommen, sowie mit den 6-4 Photolyasen, die die chemisch komplizierter zu reparierenden (6-4)-Photoschäden erkennen. 

 

Cryptochrome sind mit den Photolyasen eng verwandt, stellen jedoch im Gegensatz zu diesen Photorezeptoren dar, die es verschiedenen Organismen ermöglichen auf blaues Licht zu reagieren, z. B. bei der Tag-Nachtzykluskontrolle, oder der Bewegung von Chloroplasten in pflanzlichen Zellen (Essen, 2006). Zusammen mit der Arbeitsgruppe von A. Batschauer (FB Biologie) klärten wir kürzlich die Struktur des Cryptochroms 3 aus Arabidopsis thaliana auf (Klar et al., 2007), dessen biologische Funktion noch nicht hinreichend geklärt ist, für das aber berichtet worden ist, dass es ebenfalls DNA reparieren kann. Eine andere Klasse von Photorezeptoren sind BLUF-Domänen enthaltende Proteine (sensors for blue light using FAD), die in Bakterien an unterschiedlichsten Reaktionen beteiligt sind. Nach Absorption von blauem Licht durch ihren Cofaktor FAD treten sie mit anderen Proteinen in Wechselwirkung und regulieren somit z.B. die Kontrolle der Expression von Photosynthesegenen, Regulation von Enzymen oder das Schwimmverhalten von Einzellern.

Weitere in unserer Arbeitsgruppe untersuchte pigment-haltige Proteine umfassen Dodecine, eine von uns mit D. Oesterhelt (MPI Biochemie) entdeckte Klasse ungewöhnlicher Flavoproteine (Bieger et al., 2003), sowie Phytochrome (Zusammenarbeit mit J. Hughes, Univ. Giessen), die als Rotlichtrezeptoren mannigfache Funktionen in Pflanzen und vielen Bakterien ausüben. Unser Ziel ist die kristallographische und biophysikalische Analyse von Photorezeptoren, insbesonders die Frage, wie die Absorbtion von Licht Strukturänderungen in diesen Proteinen vorantreibt.

 

Strukturstudien an Membranproteinen

 

Obwohl 20 bis 30 % der bisher sequenzierten genetischen Information für Membranproteine codieren,  stellen sie nur 0.2 % der bis heute aufgeklärten Proteinstrukturen dar. Demgegenüber steht die Tatsache, dass Membranproteine bedeutende Ziele für die Pharmaforschung dar-stellen. So wirken mehr als 60 % der Medikamente auf dem Markt direkt oder indirekt auf Membran-assoziierte Proteine oder Protein-komplexe.

 

Membranproteine aus Helicobacter Pylori

 

Membranproteine stellen den Wissenschaftler aufgrund ihrer intrin-sischen Eigenschaften (Hydrophobie, geringe Expressionsraten, Stabilität usw.) vor eine Vielzahl von Herausforderungen. Diesen versucht man in neuerer Zeit mittels internationaler Hochdurchsatz-Projekte zu begegnen. An zwei von diesen Projekten, ProAMP und €-MeP, ist unsere Arbeitgruppe beteiligt. Hauptaugenmerk liegt dabei auf einer Auswahl von Membranproteinen aus dem Humanpathogen Helicobacter pylori.

 

 

 

 

 

    Ionen-transportierende ATPasen

 

Die Untereinheiten b und d des so genannten Stators oder "second stalk" der F₀F₁-ATPase sind grundlegend für die funktionelle Kopplung zwischen den rotierenden und stationären Einheiten des Enzyms.

 

Die Struktur und Funktion der natürlicherweise in Actinomy-ceten vorkommenden Protein-fusionen bxd und x d ist bislang nicht bekannt und soll unter-sucht werden.

 

 

 

Protein engineering an Membranproteinen

 

Hochsymmetrische Fusionsproteine

 

Ein Ansatz, um  die Kristallisationseingeschaften von Proteinen zu verbessern, besteht darin, Proteinfusionen zwischen dem Zielprotein und einem anderen Protein herzustellen. Hierdurch sollen die  Charakteristika des Zielproteins modifiziert und möglichst um erwünschte Eigenschaften des Fusionspartners erweitert werden. Die hochsymmetrischen dodekameren Proteine MrgA und Dodecin dienen uns dabei als Grundgerüst für die Fusion. Beide zeichnen sich durch eine hohe Stabilität sowie ausgezeichnete Kristallisierbarkeit aus. Diese Methode könnte insbesondere bei Membranproteinen Anwendung finden.

 

 

 

 Hybride Membranproteine

Dieses Projekt beschäftigt sich mit bakteriellen Porinen, diein der äußeren Membran von gram-negativen Bakterien wie Escherichia coli lokalisiert sind. Durch kombinierte Anwendung von molekularbiologischen und proteinchemischer Techniken und biochemisch synthetischer Methoden  ist es uns möglich, strukturelle Modifizierungen am Zielprotein vorzunehmen, die weit über den klassischen Möglichkeiten liegen. So könnte sich beispielsweise durch künstlich eingeführte sterische Barrieren (siehe Abb. rechts) die Ionenleitfähigkeit natürlicher Porine modifizieren bzw. steuern lassen  (Kooperation AG Koert, FB Chemie).

 

 

             

         Nicotinsäure-Fermentation

Nikotinsäure ist ein Vorläufer des wichtigen Kofaktors Nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD+ bzw. NADP+). Einige Mikro-organismen, wie beispielsweise Eubacterium barkeri, sind in der Lage diese in einzigartiger Weise auf anaeroben Wege zu verstoffwechseln. Ziel der laufenden Untersuchungen ist neben der funktionellen Charakterisierung von Enzymen des Nikotin-säure-Abbauwegs die Bestimmung dreidimensionaler Strukturen dieser Proteine mittels röntgenographischer  Methoden (Kooperation AG Pierik, FB Biologie).

 

                         

              

                   Antibiotika-Synthese

   
Viele der von Mikroorganismen produzierten Peptidantibiotika enthalten neben den proteinogenen L-Aminosäuren auch andere chemische Bausteine. Die Synthese dieser meist zyklischen Verbindungen erfolgt an multimodularen Enzymkomplexen, den nicht-ribosomalen Peptid-Synthetasen (NRPS). Wie an einem Fließband werden schrittweise die Bausteine aus-gesucht, aktiviert und an das enzymgebundene Intermediat  ange-hängt. Am Ende dieser Synthese werden die Peptide durch so ge-nannte Thioesterase-Domänen abgespaltet und dabei z. T. zyklisiert oder oligomerisiert. Wir untersuchen diese Domänen, um besser zu verstehen, wie die beobachtete Regio- und Stereoselektivität erreicht wird (Kooperation AG Marahiel, FB Chemie).