06.04.2021 Radikale Methode zur enzymatischen Knüpfung von C-C-Bindungen

Enzym schaffen viele Reaktionen, die mit den Methoden der organischen Chemie nicht funktionieren. Ein interessantes Beispiel dafür ist die Ausbildung von C-C Bindungen zwischen nicht aktivierten Kohlenwasserstoffen und ungesättigten Verbindungen, z. B. Fumarat. Diese Reaktionen werden von einer Subgruppe der Glycyl-Radikal-Enzyme, den Fumarat-addierenden Enzymen katalysiert, die eine Schlüsselrolle im anaeroben bakteriellen Kohlenwasserstoffabbau haben und so zur biologischen Sanierung belasteter Standorte beitragen. Diese Enzyme werden seit Jahren in der Gruppe des Marburger Mikrobiologie-Professors Dr. Johann Heider untersucht, der in Kooperation mit Prof. Dr. Maciej Szaleniec vom Jerzy-Haber Institut in Krakau in der Fachzeitschrift „ACS Catalysis“ neue Ergebnisse zu ihrem Mechanismus und ihrer biotechnologischen Anwendbarkeit vorstellt.

Das Modellsystem dieser Enzyme ist die Benzylsuccinat Synthase (BSS), die aus Toluol und Fumarat stereospezifisch (R)-Benzylsuccinat synthetisiert. Dieses Enzym ist nur nach der Konversion eines konservierten Glycins im aktiven Zentrum zum Glycyl-Radikal aktiv und in dieser Form extrem sensitiv gegen Inaktivierung durch Sauerstoff. Zudem konnte aktive BSS bisher nur in geringen Mengen aus wenigen anaeroben Toluol-abbauenden Bakterien gewonnen werden, was die Verfügbarkeit und Handhabung des Enzyms sehr behindert. Im neuen Manuskript wird erstmals eine Methode zur rekombinanten Produktion aktivierter BSS vorgestellt, die auch bereits zur Charakterisierung einiger gezielt hergestellter Mutanten genutzt wurde.

Durch die Arbeit wird der postulierte Mechanismus der BSS weiter bestätigt, der aus der Kristallstruktur des nicht aktivierten Enzyms und mathematischen Modellrechnungen erstellt wurde. Danach binden zunächst beide Substrate, Toluol und Fumarat, in einer Tasche des Enzyms, während sich dieses in der relativ stabilen Glycyl-Radikalform befindet. Das Fumarat wird dabei durch Kontakte der beiden Carboxyl-Gruppen mit einem konservierten Arginin und Proteinrückgrat-Atomen gebunden, während das Toluol durch hydrophobe Aminosäuren der Wand der Bindungstasche passend ausgerichtet wird. Die Reaktion verläuft dann über eine Radikalkaskade: zunächst abstrahiert das Glycylradikal ein Wasserstoffatom von einem konservierten Cystein im aktiven Zentrum, was ein hochreaktives Thiyl-Radikal erzeugt, das dann Toluol zu einem Benzyl-Radikal aktiviert. Dieses Substratradikal addiert an die Doppelbindung von Fumarat und bildet ein Benzylsuccinyl-Produktradikal, das über eine rückläufige Radikalkaskade weiter umgesetzt wird: ein Wasserstoff-Atom wird zunächst vom Cystein abgezogen, um das Produkt zu generieren, das Radikal wandert wieder zurück auf Glycin und das Produkt wird aus der Bindetasche entlassen.

Die weiterführenden Fragen der aktuellen Studie ergaben sich aus den Arbeiten am Mechanismus der BSS. So sind z. B. in der hydrophoben Bindungstasche von BSS zwei Isoleucine konserviert, die nur in zwei bekannten Xylol-umsetzenden Enzymen durch Valine ersetzt sind. Tatsächlich führte bereits der Austausch einer dieser Aminosäuren zu einer Enzym-Variante, die zusätzlich zu Toluol auch m-Xylol umsetzt. Die experimentellen Daten wurden durch moleküldynamische Berechnungen am Computer bestätigt, durch die eine spezifische Erweiterung des Substratspektrums für m-Xylol bestätigt wurde. Dabei ist besonders bemerkenswert, dass die Effekte eines einzigen zusätzlichen C-Atoms im Substrat durch die Wegnahme eines einzigen C-Atoms im Enzym kompensiert werden.

En weiteres Ziel für gezielte Mutagenese war das Fumarat-bindende Arginin, das in allen bekannten Fumarat-addierende Enzymen konserviert ist. Dennoch war es möglich, diese Aminosäure durch ein Lysin zu ersetzen, ohne die Aktivität der BSS verlieren. Diese Mutante zeigte zusätzlich noch eine bemerkenswerte weitere Aktivität, nämlich die Bildung eines Addukts aus Toluol und dem Fumarat-Analog Acetylacrylat, bei dem eine der beiden Carboxylgruppen durch eine Ketogruppe ersetzt ist. Insgesamt zeigen die Ergebisse der Studie, dass BSS (sowie auch andere Fumarat-addierende Enzyme) offenbar nicht nur ihre physiologischen Reaktionen katalysieren, sondern mit einfachen Veränderungen auch zur Katalyse neuartiger Additionsreaktionen zwischen Kohlenwasserstoffen und Olefinen gebracht werden können. Somit öffnet sich hier eventuell ein neuer Weg für die Anwendung dieser Enzyme für verschiedene C-C Verknüpfungen in synthetischen Ansätzen.

Mitwirkende:

Professor Dr. Johann Heider lehrt mikrobielle Biochemie an der Philipps-Universität Marburg. Professor Dr. Maciej Szaleniec leitet seit 2010 das Labor für Biotechnologie und Enzymkatalyse und ist zur Zeit Vize-Direktor des Jerzy-Haber Instituts in Krakau.

Neben den Arbeitsgruppen von Heider und Szaleniec beteiligten sich Dr. Uwe Linne von der Universität Marburg und Rainer Meckenstock von der Universität Duisburg-Essen an der Studie. Die Deutsche Forschungsgemeinschaft und das National Science Center Poland förderten die zugrunde liegende wissenschaftliche Arbeit über das Beethoven Life Grant Programm (He2190/7-2, He2190/13-1, 2018/31/F/ 619 NZ1/01856); weitere Unterstützung kam unter anderem von PL-Grid (Cyfronet) und vom LOEWE-617 Zentrum für Synthetische Mikrobiologie.

 Originalveröffentlichung: Salii I., Szaleniec M., Alhaj Zein A., Seyhan D., Sekula A., Schühle K., Kaplieva-Dudek I., Linne U., Meckenstock R. U. & Heider J. (2021) Determinants for substrate recognition in the glycyl radical enzyme benzylsuccinate synthase revealed by targeted mutagenesis. ACS Catal.11, 3361-3370

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