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Zellfreie und in vitro Prototypisierung
Lars Voll, Clemens Böhm
Fragestellung
Wie können zellfreie Chloroplasten-basierte TXTL (Transkriptions/ Translations)-Systeme für die Prototypisierung metabolischer und genetischer Netzwerke optimiert werden?
Zusammenfassung
Die Expressionsstärke von stabil integrierten Transgenen im Chloroplasten-Genom von C. reinhardtii ist schwer vorhersagbar und bedarf eines vorherigen Tests geeigneter Steuerelemente in einer möglichst natürlichen Umgebung. Der Einsatz zellfreier Chloroplasten-Extrakte für die Prototypisierung von Steuerelementen für metabolische und genetische Netzwerke wurde 2021 im Rahmen des mit dem Grand Prize gekrönten studentischen iGEM-Projektes OpenPlast etabliert und wurde in der Zwischenzeit von den beteiligten Laboren weiterentwickelt (Böhm et al., 2024). Dabei zeigte sich eine sehr gute Übertragbarkeit für stromabwärts liegende Steuerelemente (3‘UTRs) bei drei höheren Pflanzen (Tabak, Spinat, Weizen), wohingegen stromaufwärts liegende Steuerelemente (5’UTRs) einen starken Einfluss auf die Bildung des Reporterproteins NanoLuc in Chloroplasten-Extrakten der drei Pflanzenarten hatten (https://2021.igem.org/Team:Marburg/Results). Ebenso funktionierte ein für C. reinhardtii optimierter Baustein sehr effizient in Chloroplasten-Extrakten höherer Pflanzen (https://2021.igem.org/Team:Marburg/Results). In C1 werden wir bevorzugt auf das bereits etablierte TXTL System aus Spinat zurückgreifen, da die Isolation intakter Chloroplasten aus C. reinhardtii schwierig und ineffizient ist.
Aus der MoClo Marburg Collection stehen 157 Steuerelemente aus höheren Pflanzen zur Verfügung (https://2021.igem.org/Team:Marburg/Part_Collection), die allesamt in der allgemein gebräuchlichen Golden Gate MoClo-Syntax erstellt worden sind . Die Erweiterung des MoClo-Baukastens mit Steuerelementen aus C. reinhardtii (siehe C2) hat bereits begonnen.
In Projekt C1 wollen wir
- die multiparallele Quantifizierung von Translationseinheiten in zellfreien Chloroplasten-Extrakten etablieren,
- dafür geeignete genetische Elemente identifizieren und diese
- zur Etablierung von metabolischen Netzwerken in zellfreien Systemen, sowie
- zur stress-stabilen bzw. stress-induzierten Gen-Expression in Chloroplasten einsetzen.
Referenzen
Böhm CV, Inckemann R, Burgis M, Baumann J, Brinkmann CK, Lipinska KE, Giles S, Freudigmann J, Seiler V, Clark LG, Jewett MC, Voll LM*, Niederholtmeyer H* (2024) Chloroplast Cell-free systems from different plant species as a rapid prototyping platform. ACS Synth Biol. 13: 2412-2424. https://doi.org/10.1021/acssynbio.4c00117
