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Standardisierte Assemblierung von genetischen Elementen: plastidäres MoClo Kit
Anke Becker, Swagatam Maity
Fragestellung
Welches Set genetischer Bausteine ermöglicht das Umschreiben des C. reinhardtii Chloroplasten-Genoms, sowie die Expressionskontrolle nativer und synthetischer plastidärer Gene? Ermöglicht die Entwicklung eines Modularen Klonierungs-Kits (MoClo) ein effizientes automatisiertes Genome Engineering von C. reinhardtii Chloroplasten?
Hintergrund
Standardisierung und Modularisierung sind Schlüsselkonzepte der Synthetischen Biologie. Hierzu zählen auch DNA-Assemblierungsstandards und modulare Klonierungsstrategien. Diese ermöglichen durch Zusammenführen mehrerer DNA-Bausteine in einem Schritt und durch kombinatorische Flexibilität die hocheffiziente Herstellung von DNA-Konstrukten und Prototypisierung einer Vielzahl an Designvarianten.
Modulare Klonierungsstandards, die Typ IIS-Restriktionsenzyme nutzen, haben sich als besonders leistungsfähig und flexibel erwiesen. Da diese Restriktionsenzyme außerhalb ihrer Erkennungsstelle jede DNA-Sequenz in vorgegebener Orientierung und Distanz schneiden können, sind die erzeugten einzelsträngigen Überhänge für eine gerichtete Assemblierung programmierbar. Deshalb können Standards entworfen werden, die für die Assemblierung mehrerer DNA-Bausteine nur ein Restriktionsenzym benötigen und Systeme zum hierarchischen Assemblieren größerer Einheiten, die mit nur zwei bis drei Restriktionsenzymen auskommen. Dies reduziert den Aufwand für die so genannte "Domestizierung" von DNA-Bauteilen durch die Eliminierung der verwendeten Restriktionsenzymerkennungsstellen.
Der MoClo-Standard wird vielfältig in der Synthetischen Biologie genutzt und es wurden umfangreiche MoClo-Standard-kompatible Bibliotheken mit vordefinierten DNA-Teilen für verschiedene Modellorganismen entwickelt. Hierzu zählt die Marburg Collection für bakterielle Chassis und ein MoClo-Kit für Zellkern-basierte Genexpression in C. reinhardtii, die unter Mitwirkung unseres Konsortiums entwickelt wurden. Diese Kits werden kontinuierlich weiterentwickelt und durch neue Elemente ergänzt und komplementiert.
