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Proteomics - Methodenwahl

Proteomics - Application overview

  1. Protein identification (gel or solution; quality control, is a specific protein present in a sample ?, which protein is it ?, etc.)
  2. Detection of binding partners after immuno-precipitation experiments (design of expriment and controls important; usually verification of identified binding partners by other methods)
  3. Mass Spectrometry focusing on all proteins in a cell - usually comparative (relative quantitative) or absolute quantitative - with or withour label
  4. PTM-analysis (e.g. phosphorylation), also proteome-wide

Alle im Folgenden erläuterten Methoden können mit der Analytik von PTMs kombiniert werden.

  • Qualitative Identifizierung (u.a. als Qualitätskontrolle für gereinigte Proteine oder Identifizierung von Bindungspartnern nach Pull-Downs und Interaktionsstudien)

    Bei der qualitativen Bestimmung werden in der Probe vorhandene Proteine oder auch post-translationale Modifikationen (PTMs) qualitativ identifiziert. Es erfolgt aber keinerlei quantitative Auswertung. In einem 1D-Lauf (4h) an der Orbitrap Velos können so im Idealfall ohne Vortrennung 2500-3000 Proteine nebeneinander identifiziert werden. Sie kann aber auch schlicht zur Einzelidentifizierung von Proteinen genutzt werden um z.B. die Identität von gereinigten Proteinen zweifelsfrei zu belegen, Protein-Verunreinigungen in Präparationen auf zu klären oder Interaktionspartner nach Pull-Downs zu identifizieren.

  • Quantitative Proteinidentifizierung - relativ

    Wie der Name schon sagt können hier unterschiedliche Proben relativ zueinander verglichen werden. Es können aber keine Rückschlüsse auf absolut vorhandene Mengen gezogen werden. Für die relative Quantifizierung kommen sowohl die experimentell einfachere Label-freie Quantifizierung in Frage als auch der Einsatz unterschiedlicher Label. Beim Label-freien Ansatz wird ein interner Standard, der nicht in der eigentlichen Probe enthalten sein darf und der in definierter Konzentration zugegeben wird, zur Normierung der unterschiedlichen nano-LC-MSMS-Läufe heran gezogen. Etabliert haben wir neben dem Label-freien Ansatz SILAC sowie das Dimethyl-Labeling. Bei letzterem können bis zu drei Zustände/Proben miteinander verglichen werden. Generell erreicht man eine Unterscheidung mehrerer Proben durch den Einbau stabiler Isotope, die zu Massenshifts führen. Somit können mehrere Proben nebeneinander in ein und demselben nanoLC-MSMS-Lauf ausgewertet werden. SILAC unterscheidet sich insofern vom Dimethyl-Labeling, als dass der Einbau von stabilen Isotopen bereits in der Zellkultur - also auf Nutzerseite - erfolgen muss, während er beim Dimethyl-Labeling durch chemische Modifikation während der Probenvorbereitung bei uns im Labor erfolgt. Als schwere Isotope kommen dabei Deuterium sowie 13C und 15N, seltener auch 18O zur Anwendung. Es gibt eine ganze Reihe kommerzieller Reagenzien für Labeling-Techniken. So z.B. die TMT-Reagenzien sowie die iTRAQ-Reagenzien. Teilweise erreicht man ein Multiplexing von 10 oder gar mehr Zuständen. Diese Reagenzien - mit Ausnahme des Dimethyl-Labelings auf Basis von Formaldehyd - sind aber relativ teuer und man benötigt teilweise spezielle Auswertesoftware.

  • Quantitative Proteinidentifizierung - absolut

    Für die absolute Quantifizierung gibt es zwei Methoden. Aufgrund der Einfachheit verwenden wir standardmäßig die Label-freie Quantifizierung und ziehen den orthogonalen internen Standard, der nicht in der eigentlichen Probe enthalten sein darf und der in definierter Konzentration zugegeben wird, zur absoluten Quantifizierung heran. In der Regel ist dies ein kommerziell erhältliches Protein entsprechender Reinheit. Dieser Standard dient zum Einen der Normierung unterschiedlicher nano-LC-MSMS-Läufe, aber eben auch dem Errechnen der absoluten Konzentrationen der identifizierten Proteine.

    Eine "targeted"-Methode ist die Verwendung von AQUA-Peptiden. Das sind synthetische isotopenmarkierte Peptide, die in definierten Konzentrationen in die Proben gespiked werden. In einem ersten Schritt werden Proteine und Peptide identifiziert. Geeignete Proteine werden dann in einer Auftragssynthese isotopenmarkiert hergestellt. In einem zweiten Schritt erfolgt dann die - sehr genaue - absolute Quantifizierung der Zielproteine. Es ist klar, dass diese Methode aufwändig und teuer ist. Wir haben sie aus diesen Gründen - und auch weil meist die geringere Genauigkeit der Label-freien Methode (~ 20% Abweichung möglich) immer noch unter der natürlichen biologischen Varianz liegt - bisher nicht verwendet. In Einzelfällen kann sie aber vorteilhaft sein.